UDI? UMI?文庫構(gòu)建試劑盒如何選擇

更新時間：2020-10-10 點(diǎn)擊次數(shù)：2305

相信有些小伙伴已經(jīng)隱隱約約有聽說過UDI和UMI這兩個英文縮寫，但是一直沒搞清楚它們?nèi)巧叮克鼈兡芨缮叮?/span>

在正文開始前，我們先來“揭秘”UDI和UMI的全稱：
UDI的全稱為Unique Dual Index，譯為雙端不重復(fù)標(biāo)簽技術(shù)。
UMI的全稱為Unique Molecular Identifier，譯為分子條形碼或者分子標(biāo)簽技術(shù)。
別急，要弄清這兩個概念，還得從二代測序的那些事情說起：
我們都知道二代測序技術(shù)是近十年來曝光率非常高、非常受關(guān)注的基因組分析技術(shù)。以Illumina為代表的測序儀廠商不斷推出更新型號的測序儀，不斷刷新測序通量，但不變的仍是多樣本混合后測序的策略。
要實(shí)現(xiàn)對多個樣本同時測序，必須在各樣本PCR擴(kuò)增階段，往核酸片段上添加一段分子序列作為樣本標(biāo)簽，這種標(biāo)簽叫做index。

這樣，每個樣本就帶上屬于它的“專屬號碼牌”，在多樣本混合測序后，生信工程師能通過“翻牌”，確定這個“號碼”所代表的就是“尋尋覓覓”的那個“它”。

Index一般由8位堿基所組成，常有單端與雙端兩種添加模式，為了增加同時上樣的通量，大家一般在面臨大量樣本同時測序時，會選擇雙端index↓

目前常用的雙端index策略是通過少數(shù)幾種index序列排列組合，去實(shí)現(xiàn)更多樣本的標(biāo)簽區(qū)分（如96種），但這種方式一直存在交叉污染的可能。

同時，為了進(jìn)一步提升通量與擴(kuò)增效率，降低測序成本，Illumina為Novaseq等高通量型測序儀引入了圖案化流動槽（Patterned Flow Cell Technology，PFCT）和排他性擴(kuò)增（Exclusion Amplification，ExAmp）成簇技術(shù)。這兩個看似美好的技術(shù)卻無意間放大了一種叫做標(biāo)簽跳躍（index hopping）的樣本標(biāo)簽錯配的現(xiàn)象，導(dǎo)致科研人員無法正確拆析樣本與數(shù)據(jù)的關(guān)系，終可能與重大發(fā)現(xiàn)“失之交臂”。

為了降低標(biāo)簽跳躍，Illumina在可以使用UDI雙端特殊標(biāo)簽對樣本進(jìn)行標(biāo)記，混樣后進(jìn)行測序。

UDI的引入使得文庫兩端的index序列是不重復(fù)，一對一組合的，不存在共用。換句話說，只有兩端帶有*正確index序列的reads才能進(jìn)入后續(xù)的樣本分析，從而可以剔除標(biāo)簽錯配的reads，有效避免樣本之間的數(shù)據(jù)串?dāng)_。

一句話總結(jié)：采用UDI策略，能更正確拆解測序數(shù)據(jù)與樣本之間的一一對應(yīng)關(guān)系，減小樣本“戴錯號碼牌”的概率。

下面再來講講名為分子標(biāo)簽技術(shù)的UMI：

UMI的原理就是給每一條原始核酸片段加上一段*的標(biāo)簽序列，經(jīng)PCR擴(kuò)增后一起進(jìn)行測序。這樣根據(jù)不同的標(biāo)簽序列，生信人員就能區(qū)分不同來源的DNA模板，分辨哪些是PCR擴(kuò)增及測序過程中的隨機(jī)錯誤造成的假陽性突變，哪些是患者真正攜帶的突變，從而提高檢測靈敏度和特異性。

一些需要較高正確度的應(yīng)用，如腫瘤稀有突變分析，常會對5%、甚至1%左右的稀有變異作檢測。這時一旦出現(xiàn)測序錯誤、或者PCR偏差，便會產(chǎn)生大量假陽性結(jié)果，因此需要添加UMI進(jìn)行校正。

一句話總結(jié)：做稀有突變檢測、校正測序錯誤與PCR偏差，UMI“勞苦功高”。

看到這里，關(guān)于UDI和UMI的介紹已基本完成。

接下來我們來看一個實(shí)際案例應(yīng)用。

近我們收到一位寶粉的來信，咨詢我們Takara有沒有什么好的文庫構(gòu)建方案↓

我們了解到這位寶粉的團(tuán)隊
① 近正在研發(fā)腫瘤稀有突變分析的項目；
② 樣本類型主要是FFPE(石蠟包埋樣本)、cfDNA（游離DNA）；
③ 起始量大概在幾十ng；④準(zhǔn)備自己建庫，然后送樣測序，平臺是Novaseq；
⑤ 由于是剛接觸建庫實(shí)驗，不希望操作太復(fù)雜。
我思考了大概1秒鐘，就從我們豐富的DNA-Seq文庫構(gòu)建產(chǎn)品線中找到了一款合適的產(chǎn)品↓

ThruPLEX Tag-Seq HV

為什么說這款產(chǎn)品合適呢？我們來對標(biāo)這位寶粉的幾個需求。

需求1：希望操作簡便，不要太繁瑣

對標(biāo)1：ThruPLEX Tag-Seq HV這款試劑盒支持單管、三步操作，手動15 min，全程2 h，無需在建庫過程中轉(zhuǎn)管或純化。

我們比較了ThruPLEX HV和K、N兩家公司的試劑盒，只有ThruPLEX是單管操作、時間短、操作便捷的系統(tǒng)。

所以，無論新手還是老手，都能很快上手！

需求2：樣本類型為FFPE DNA、cfDNA，起始量大概在幾十ng

對標(biāo)2：ThruPLEX Tag-Seq HV支持5-200 ng FFPE DNA、cfDNA起始，input volume為30μl，無需樣品濃縮。

需求3：Novaseq測序分析稀有變異

對標(biāo)3：ThruPLEX Tag-Seq HV搭配UDI建庫，可以有效降低index hopping效應(yīng)，是高通量型Illumina測序儀的“友好伙伴”

ThruPLEX Tag-Seq HV莖環(huán)形接頭上還包含7位堿基的固定型UMI，雙端總共可有144種UMI連接到DNA分子兩端，以識別一致序列，減少擴(kuò)增或者測序錯誤帶來的假陽性突變。

再舉幾個例子

Takara科學(xué)家采用ThruPLEX Tag-Seq HV對10 ng起始的Quan-Plex Patient-Like ctDNA標(biāo)準(zhǔn)品（AccuRef）構(gòu)建文庫，腫瘤相關(guān)的基因采用IDT xGEN Pan Cancer Panel進(jìn)行捕獲富集，隨后用UMIs鑒定了ctDNA標(biāo)準(zhǔn)品中特定位點(diǎn)的實(shí)際突變頻率。結(jié)果顯示，檢測到的突變頻率分別與預(yù)期1%、5%的等位突變頻率接近，而陰性對照組沒有在位點(diǎn)處檢測到任何突變。

同時，為了比較UMI與常規(guī)使用的坐標(biāo)法之間的效果差異，Takara科學(xué)家先使用未去重或者僅用坐標(biāo)法去重的文件分析，在預(yù)期的EGFR L858R突變附近觀察到大量的低頻及隨機(jī)等位基因頻率突變。而隨后用UMI校正、過濾數(shù)據(jù)后，清除了假陽性突變，得到了預(yù)期的突變分析結(jié)果！

經(jīng)過幾場對標(biāo)，我們明確了ThruPLEX Tag-Seq HV能滿足那位寶粉開發(fā)cfDNA/FFPE DNA稀有突變項目的需求。

當(dāng)然，若小伙伴們也有同等需求，ThruPLEX Tag-Seq HV定能不負(fù)所望。

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